Jumat, 19 Juli 2013

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

1.      Pengertian HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

 

1.      JENIS- JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. 
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. 
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.      Beberapa kegunaan dari HPLC :
·         HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
·         Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
·         Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
·         Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
·         Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
·         Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
·         Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

3.      Aplikasi dalam ilmiah
Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA molecules that differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi,  They can also help to identify the genes that cause certain human diseases.dan  juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.
Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:
·         Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam airrumus kimiaC23H27N. Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.





1.      Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
·         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
·         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
·         Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
·         Kolom dapat digunakan kembali.
·         Waktu analisa cukup singkat.
·         HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
·         Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
·         Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
·         Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
·         Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
·         Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.


2.      Prinsip kerja
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.
Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.


  

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

Waktu retensiWaktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
·         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
·         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
·         komposisi yang tepat dari pelarut
·         temperatur pada kolom
DetektorAda beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

  
1.      Perawatan HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom, namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum,  kolom yang sering digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.



Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
·         Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
·         Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
·           Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
·           Penyimpanan Kolom
v  Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.
v  Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
v  Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah pelarut Asetonitril.

Read more ...
Selasa, 21 Mei 2013

tugas 3 Tanya Jawab Essay


Jawab:
cara mengetahui bahwa suatu bahan makanan mengandung protein
adalah dengan uji protein gan
ada 4 cara yaitu

1. Uji xantoprotein,
uji xantoprotein dapat digunakan untuk menguji atau mengidentifikasi
adanya senyawa protein karena uji xantoprotein dapat menunjukan adanya senyawa
asam amino yang memiliki cincin benzene seperti fenilalanin, tirosin, dan tripofan.
Langkah pengujianya adalah larutan yang diduga mengandung senyawa protein
ditambahkan larutan asam nitrat pekat sehingga terbentuk endapan berwarna putih.
Apabila larutan tersebut mengandung protein maka endapat putih tersebut apabila
di[anaskan akan berubah menjadi warna kuning.

2. Uji biuret,
uji biuret ini dapt digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan peptide dalam
suatu senyawa sehingga uji biuret dapat dipakai untuk menunjukan adanya senyawa
protein. Langkah pengujian yang dapat dilakukan adalah larutan sampel yang diduga
mengandung protein ditetesi dengan larutan NaOH kemudian diberi beberapa tetes
larutan CuSO4 encer. Apabila larutan berubah menjadi arna unggu maka larutan
tersebut mengandung protein.

3. Uji millon, Uji millon dapat digunakan untuk menguji atau mengidentifikasi adanya
senyawa protein yang memiliki gugus fenol seperti tiroksin. Pereaksi millon terdiri dari
larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.adanya protein dalam sempel dapat
diketauhi apabila dalam sampel terdapat endapan putih dan apabila endapan putih itu
dipanaskan akan menjadi warna merah.

4. Uji belerang, uji belerang dapat digunakan untuk menguji atau mengidentifikasi adanya
senyawa protein karena dapat menunjukan asam amino memiliki gugus belerang seperti
sistin dan metionin. Langkah pengujianya adalah larutan sampel ditambahkan NaOH pekat
kemudian dipanaskan. Selanjutnya keda;am larutan ditambahkan pula larutan timbale asetat.
Apabila ;larutan mengandung sasam amino yang memiliki gugus belerang maka warna
larutan atau endapat berwarna hitam. Yaiti senyawa timbale sulfide (PbS)

Jawab :
Glikoprotein adalah suatu protein  yang mengandung rantai oligosakarida  yang mengikat glikan  dengan ikatan kovalen  pada rantai polipeptida  bagian samping. Struktur ini memainkan beberapa peran penting di antaranya dalam proses proteksi imunologis, pembekuan darah, pengenalan sel-sel, serta interaksi dengan bahan kimia lain. Dengan kata lain glikoprotein adalah Ini adalah biomolocule terdiri dari karbohidrat dan protein.. Contoh glikoprotein adalah Alpha-1-acid glycoprotein (AGP)atau orosomucoid (ORM). Yaitu suatu fase akut plasma alpha globulin glikoprotein dan dimodulasi oleh dua gen polimorphic.

Jawab :
Denaturasi protein adalah berubahnya struktur protein dari struktur asalnya atau struktur alaminya. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan terjadinya denaturasi protein yaitu suhu tinggi,  perubahan pH yang ekstrim, pelarut organik, zat kimia tertentu (urea dan detergen), atau pengaruh mekanik (guncangan).

Jawab :
Denaturasi protein kehilangan fungsi biologisnya karena protein mengalami perubahan struktur sehingga menyebabkan dapat gangguan terhadap aktivitas sel dan kemungkinan kematian sel.

Jawab :
Iya, urea memberikan hasil positif pada uji biuret karena urea mempunyai ikatan peptida di dalamnya.

Jawab :
Struktur kuartener protein adalah di mana protein terdiri atas 2 rantai polipeptida atau lebih dan di satukan oleh gaya dispersi (ikatan hydrogen).
7.    Suatu sampel ditetesi larutan NaOH, kemudian larutan tembaga(II) sulfat yang encer menghasilkan warna ungu. Bila sampel dipanaskan dengan HNO3 pekat kemudian dibuat alkalis dengan NaOH terjadi warna jingga. Apakah yang dapat anda simpulkan dari uji di atas?
            Jawab :
Dari hasil uji di atas dapat di simpulkan bahwa sample mengandung ikatan peptida dan mengandung gugus fenol (cincin benzena).
  

8.    Suatu sampel memberi hasil yang positif terhadap uji ninhidrin dan biuret tetapi negatif terhadap penambahan larutan NaOH dan Pb(NO3)2. Kesimpulan apakah yang dapat diperoleh dari fakta tersebut?
Jawab :
Sample mengandung protein dan ikatan peptide tetapi tidak mengandung belerang di dalamnya.
9.    Apakah yang dimaksud dengan enzim? Berikan contohnya!
Jawab :
Enzim adalah biomolekul  berupa protein  yang berfungsi sebagai katalis  (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia  organik . Contohnya adalah laktase , alkohol dehidrogenase  (mengatalisis penghilangan hidrogen dari alkohol), dan DNA polimerase .

10.  Bila 20 molekul glisin berpolimerisasi membentuk polipeptida. Berapakah massa molekul relatif polipeptida yang terbentuk? Ar H = 1, C = 12, N = 14, O = 16).
Jawab :
1440 g/mol
Read more ...
Rabu, 08 Mei 2013

Protein


Protein merupakan senyawa polimer organik yang berasal dari monomer asam amino yang mempunyai ikatan peptida. Istilah protein berasal dari bahasa Yunani “protos” yang memiliki arti “yang paling utama”.
Protein memiliki peran yang sangat penting pada fungsi dan struktur seluruh sel makhluk hidup. Hal ini dikarenakan molekul protein memiliki kandungan oksigen, karbon, nitrogen, hydrogen, dan sulfur. Sebagian protein juga menagndung fosfor.
Protein pertama kali ditemukan pada tahun 1838 oleh Jöns Jakob Berzelius. Protein adalah salah satu biomolekul raksasa yang berperan sebagai komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein membawa kode-kode genetik berupa DNA dan RNA.
Beberapa makanan yang dapat menjadi sumber proteinadalah: daging, telur, ikan, susu, biji-bijian, kentang, kacang, dan polong-polongan.
Seorang Biokimiawan USA dan juga Profesor untuk biokimia di Yale bernama Thomas Osborne Lafayete Mendel pernah melakukan percobaan protein kepada kelinci pada tahun 1914. Sekelompok kelinci diberi makanan protein hewani. Kelompok lain diberi makanan protein nabati. Hasil dari eksperimen ini adalah kelinci yang diberi protein hewani beratnya bertambah lebih cepat daripada kelinci yang diberi makanan berprotein nabati.
Studi yang lain dilakukan oleh seorang peneliti bernama McCay dari Universitas Berkeley. Percobaan yang dilakukannya menunjukan bahwa kelinci yang diberi makanan protein nabati dapat hidup lebih sehat dan hidup dua kali lebih lama dari yang lain.
Manfaat Protein
Manfaat protein bagi tubuh kita sangatlah banyak. Protein sangat mempengaruhi proses pertumbuhan tubuh kita. Diantara manfaat protein tersebut adalah sebagai berikut:
  • Sebagai enzim. Protein memiliki peranan yang besar untuk mempercepat reaksi biologis.
  • Sebagai alat pengangkut dan penyimpan. Protein yang terkandung dalam hemoglobin dapat mengangkut oksigen dalam eritrosit. Protein yang terkandung dalam mioglobin dapat mengangkut oksigen dalam otot.
  • Untuk Penunjang mekanis. Salah satu protein berbentuk serabut yang disebut kolagen memiliki fungsi untuk menjaga kekuatan dan daya tahan tulang dan kulit.
  • Sebagau Pertahanan tubuh atau imunisasi Pertahanan tubuh. Protein ini biasa digunakan dalam bentuk antibodi.
  • Sebagai Media perambatan impuls syaraf.
  • Sebagai Pengendalian pertumbuhan.
Read more ...

Pengikut